PCR-SSCP的发展现状

核心提示:随着分子生物学技术的发展,检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问
世以后,各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推随着分子生物学技术的发展,检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问
世以后,各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展.如不对称
PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法、限制性 片段长度多态性分析等等已成
为基因分析的有力工具.但这些方法操作比较繁琐,局限性较大,或要求实验条件
高,不适合一般临床实验室使用.1989年问世的PCR-SSCP作为检测基因
突变的方法,经不断地改进和完善,更为简便、快速、灵敏,不但用于检测基因点突
变和短序列的缺失和插入,而且还被用于DNA定量分析,监测PCR诊断实验中的交叉污
染情况,以及传染源的调查等.由于SSCP的突出的优点,近几年被大量地应用.

核心提示:随着分子生物学技术的发展,检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问
世以后,各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推随着分子生物学技术的发展,检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问
世以后,各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展.如不对称
PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法、限制性 片段长度多态性分析等等已成
为基因分析的有力工具.但这些方法操作比较繁琐,局限性较大,或要求实验条件
高,不适合一般临床实验室使用.1989年问世的PCR-SSCP作为检测基因
突变的方法,经不断地改进和完善,更为简便、快速、灵敏,不但用于检测基因点突
变和短序列的缺失和插入,而且还被用于DNA定量分析,监测PCR诊断实验中的交叉污
染情况,以及传染源的调查等.由于SSCP的突出的优点,近几年被大量地应用.

核心提示:
随着分子生物学技术的发展,检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问

随着分子生物学技术的发展,检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问
世以后,各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展.如不对称
PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法、限制性 片段长度多态性分析等等已成
为基因分析的有力工具.但这些方法操作比较繁琐,局限性较大,或要求实验条件
高,不适合一般临床实验室使用.1989年问世的PCR-SSCP作为检测基因
突变的方法,经不断地改进和完善,更为简便、快速、灵敏,不但用于检测基因点突
变和短序列的缺失和插入,而且还被用于DNA定量分析,监测PCR诊断实验中的交叉污
染情况,以及传染源的调查等.由于SSCP的突出的优点,近几年被大量地应用.

一、SSCP的原理及特点

一、SSCP的原理及特点

一、SSCP的原理及特点

日本Orita等研究发现,单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象,这种立体结构主要是由
其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的,当有一个碱基发生改变时,会或多或
少地影响其空间构象,使构象发生改变,空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰
胺凝胶中受排阻大小不同.因此,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,可以非常
敏锐地将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性
分析.在随后的研究中,作者又
将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变,从而建立了PCR-SSCP技术,进一步提高了
检测突变方法的简便性和灵敏性.其基本过程是:①PCR扩增靶DNA;②将特异的PCR扩增
产物变性,而后快速复性,使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;③将适量的单
链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显
色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变,就可以判定该链构
象发生改变,进而推断该DNA片段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏,不需要特
殊的仪器,适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如,只能作为一种突变检测方
法,要最后确定突变的位置和类型,还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外,由
于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的,这样就可
能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小
时,再加上其他条件的影响,使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.尽管如此该
方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先,它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱
基突变.Takao,经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变,90%可被SSCP发
现,他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外,SSCP方
法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离,并且还可以进一步
提纯.用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段.

日本Orita等研究发现,单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象,这种立体结构主要是由
其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的,当有一个碱基发生改变时,会或多或
少地影响其空间构象,使构象发生改变,空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰
胺凝胶中受排阻大小不同.因此,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,可以非常
敏锐地将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性
分析.在随后的研究中,作者又
将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变,从而建立了PCR-SSCP技术,进一步提高了
检测突变方法的简便性和灵敏性.其基本过程是:①PCR扩增靶DNA;②将特异的PCR扩增
产物变性,而后快速复性,使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;③将适量的单
链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显
色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变,就可以判定该链构
象发生改变,进而推断该DNA片段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏,不需要特
殊的仪器,适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如,只能作为一种突变检测方
法,要最后确定突变的位置和类型,还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外,由
于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的,这样就可
能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小
时,再加上其他条件的影响,使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.尽管如此该
方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先,它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱
基突变.Takao,经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变,90%可被SSCP发
现,他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外,SSCP方
法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离,并且还可以进一步
提纯.用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段.

日本Orita等研究发现,单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象,这种立体结构主要是由
其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的,当有一个碱基发生改变时,会或多或
少地影响其空间构象,使构象发生改变,空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰
胺凝胶中受排阻大小不同.因此,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,可以非常
敏锐地将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性
分析.在随后的研究中,作者又
将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变,从而建立了PCR-SSCP技术,进一步提高了
检测突变方法的简便性和灵敏性.其基本过程是:①PCR扩增靶DNA;②将特异的PCR扩增
产物变性,而后快速复性,使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;③将适量的单
链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显
色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变,就可以判定该链构
象发生改变,进而推断该DNA片段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏,不需要特
殊的仪器,适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如,只能作为一种突变检测方
法,要最后确定突变的位置和类型,还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外,由
于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的,这样就可
能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小
时,再加上其他条件的影响,使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.尽管如此该
方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先,它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱
基突变.Takao,经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变,90%可被SSCP发
现,他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外,SSCP方
法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离,并且还可以进一步
提纯.用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段.

二、SSCP的不断改进

二、SSCP的不断改进

二、SSCP的不断改进

SSCP技术自创立以来,经历了自身发展和完善的过程,刚建立时是将同位素掺入PCR
扩增物中,通过放射自显影来显示结果.这给该技术的推广造成一定的困难,随着DNA
银染方法与PCR-SSCP结合,尤其是直接溴乙锭染色方法的应用,使得该方法大大简化.
最近,SSCP值得注意的改进是将DNA-SSCP分析,改为RNA-SSCP分析,其基本原理是:
RNA有着更多精细的二级和三级构象,这些构象对单个碱基的突变很敏感,从而提高
了检出率,其突变检出率可达90%以上.另外,RNA不易结合成双链,因此可以较大量
的进行电泳,有利于用溴化乙锭染色.但该方法增加了一个反转录过程;还需要一个较
长的引物,内含有启动RNA聚合酶的启动序列,从而相对地增加了该方法的难度.

SSCP技术自创立以来,经历了自身发展和完善的过程,刚建立时是将同位素掺入PCR
扩增物中,通过放射自显影来显示结果.这给该技术的推广造成一定的困难,随着DNA
银染方法与PCR-SSCP结合,尤其是直接溴乙锭染色方法的应用,使得该方法大大简化.
最近,SSCP值得注意的改进是将DNA-SSCP分析,改为RNA-SSCP分析,其基本原理是:
RNA有着更多精细的二级和三级构象,这些构象对单个碱基的突变很敏感,从而提高
了检出率,其突变检出率可达90%以上.另外,RNA不易结合成双链,因此可以较大量
的进行电泳,有利于用溴化乙锭染色.但该方法增加了一个反转录过程;还需要一个较
长的引物,内含有启动RNA聚合酶的启动序列,从而相对地增加了该方法的难度.

SSCP技术自创立以来,经历了自身发展和完善的过程,刚建立时是将同位素掺入PCR
扩增物中,通过放射自显影来显示结果.这给该技术的推广造成一定的困难,随着DNA
银染方法与PCR-SSCP结合,尤其是直接溴乙锭染色方法的应用,使得该方法大大简化.
最近,SSCP值得注意的改进是将DNA-SSCP分析,改为RNA-SSCP分析,其基本原理是:
RNA有着更多精细的二级和三级构象,这些构象对单个碱基的突变很敏感,从而提高
了检出率,其突变检出率可达90%以上.另外,RNA不易结合成双链,因此可以较大量
的进行电泳,有利于用溴化乙锭染色.但该方法增加了一个反转录过程;还需要一个较
长的引物,内含有启动RNA聚合酶的启动序列,从而相对地增加了该方法的难度.

为了进一步提高SSCP的检出率,可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合.其中与杂
交双链分析法结合可以大大提高检出率.Het法是用
探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交,含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互
补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开.对同一靶序列分别进行SSCP和Het
分析可以使点突变的检出率接近100%,而且实验简便.

为了进一步提高SSCP的检出率,可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合.其中与杂
交双链分析法结合可以大大提高检出率.Het法是用
探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交,含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互
补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开.对同一靶序列分别进行SSCP和Het
分析可以使点突变的检出率接近100%,而且实验简便.

为了进一步提高SSCP的检出率,可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合.其中与杂
交双链分析法结合可以大大提高检出率.Het法是用
探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交,含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互
补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开.对同一靶序列分别进行SSCP和Het
分析可以使点突变的检出率接近100%,而且实验简便.

三、PCR-SSCP的实验操作

三、PCR-SSCP的实验操作

三、PCR-SSCP的实验操作

在小于1Kb长度的情况下,DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:

在小于1Kb长度的情况下,DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:

在小于1Kb长度的情况下,DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:

DNA片段长度 丙烯酰胺
1Kb~700b 3.5
700b~500b 5
500b~200b 8
200b 12
DNA片段长度 丙烯酰胺
1Kb~700b 3.5
700b~500b 5
500b~200b 8
200b 12
DNA片段长度 丙烯酰胺
1Kb~700b 3.5
700b~500b 5
500b~200b 8
200b 12

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