细胞核移植过程与步骤

核心提示:改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育作者:沈新明1,2;乔贵林1;江培洲1;李欣1;黄华1;姚开泰1

核心提示:
所谓细胞核移植技术,就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中,使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂

核心提示:细胞核移植,就是将一个细胞核用显微注射的方法放进另一个细胞里去。前者为供体,可以是胚胎的干细胞核,也可以是体细胞的核。受

改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

所谓细胞核移植技术,就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中,使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体,使得核供体的基因得到完全复制。以供体核的来源不同可分为胚细胞核移植与体细胞核移植两种。

细胞核移植,就是将一个细胞核用显微注射的方法放进另一个细胞里去。前者为供体,可以是胚胎的干细胞核,也可以是体细胞的核。受体大多是动物的卵子。因卵子的体积较大,操作容易,而且通过发育,可以把特征表现出来,因此细胞核移植技术,主要是用来研究胚胎发育过程中,细胞核和细胞质的功能,以及二者间的相互关系;探讨有关遗传,发育和细胞分化等方面的一些基本理论问题。该技术已有几十年的历史。1952年,Briggs
和King在两栖类动物中首次获得核移植成功,使得发育生物学上的几个根本问题得到了解答。Gurdon用非洲爪蟾的上皮细胞等体细胞的核作移植,确立了已经分化的细胞核可以正常发育的事实。我国胚胎学家童第周先生等在鱼类细胞核移植方面做了许多工作。他们在1976年前后首次获得的鲤鲫移核鱼,不仅有理论意义,而且也为鱼类育种开辟了一条新的途径。

作者:沈新明1,2;乔贵林1;江培洲1;李欣1;黄华1;姚开泰1

【哺乳动物核移植技术研究进展】

哺乳动物的细胞核移植也早已引起关注,因哺乳类受精卵极小,体外培养和细胞核移植技术难度大,因此直到1981年IIImensee和Hoppe才首次报道获得成功。Mcgrath和Solter
在1983年发表了用核移植技术与细胞融合相配合的方法,能将90%以上的移核卵培养到胚泡期。经过胚胎移植,均可获得一定比例的核移植小鼠。
本实验以蛙和哺乳动物为实验材料介绍细胞核移植技术。

摘要:目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法,研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育。方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25mm左右的小口,首先将第一极体挑出,再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞,去除包含有MⅡ期染色体-纺锤体复合体的最少量细胞质。随后,将直径为10~12mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体。用电融合的方法诱导复合体融合,并对重组胚激活。体外培养72h,对重组胚发育到2细胞、4~8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数。结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15s;Hoechst33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核;去核成功率为95.5%,注核成功率为76.7%,供体核-卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2%和62.2%;重组胚体外培养72h内发育到2细胞、4~8细胞和桑椹胚期的比率分别为57.5%、39.1%和27.6%;用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物,扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段,表明重组胚来源于供体卵丘细胞。结论应用改进的核移植方法,不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核,去核成功率高,而且操作简便,去核迅速,对卵母细胞损伤小,是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法。

哺乳动物核移植是将外源的一个细胞核与一个去核卵母细胞结合,产生遗传上同质的动物的技术。它在动物育种、制备转基因动物、基因治疗及器官移植等方面具有重大的作用。

实验技术

关键词:细胞核/移植;电融合;卵母细胞;重组胚

具体方法

一、蛙的细胞核移植

中图分类号:R329.25文献标识码:A文章编号:1000-258806-0613-06

『1 供体核的获得』

受体卵的准备

核移植技术不完全成熟和重组胚基因外重新编程的异常是导致核移植效率极低的根本原因[1]。研究一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法,无疑会在促进供体核-卵母细胞复合体融合、重组胚激活和发育,以及提高核移植效率等方面起关键作用。本研究介绍了一种新的不需要通过Piezoimpact装置来完成小鼠体细胞核移植的方法,采用去核针切开卵母细胞透明带后,再对卵母细胞实施挤压和负压的方法,有效去除了卵母细胞的细胞核,并成功获得来源于小鼠卵丘细胞核移植的早期胚,为核移植研究提供了一种新的方法。

供体核可以是早期胚胎细胞、胚胎千细胞和体细胞。早期都采用合子核到64细胞期的胚胎细胞核质体分裂球作供体细胞核,80年代开始,随着胚胎干细胞(embryo
stem
cells,ES)的建立和对其研究的深入,人们对胚胎干细胞在核移植方面的应用前景寄予厚望,但ES建系太困难,仅在小鼠上获得成功。Teruhiko
Wakayama等利用ES系克隆小鼠,结果有29%的重构胚在体外能发育到囊胚阶段,移植给假孕小鼠有8%胚胎附植并产下小鼠。1997年Dolly羊的出现,开始了体细胞的核移植,并发展很快。
1.1 胚细胞
用0.2%链霉蛋白酶预处理胚胎,溶去胚胎的胶膜及透明带,分离出单个卵裂球。消化透明带的时间是影响卵裂球质量的重要因素,作用时间短,透明带不能充分消化,卵裂球不易获得;作用时间长,则影响到卵质膜,容易破裂,在操作时容易失败。因此,在分离卵裂球时应在解剖镜下监视透明带的消化过程,当透明带变薄,膨胀适度时就应移出,再用适当口径的吸管吹打使之分离。另外,苏格兰学者Campbell等显微分离胚盘细胞并在体外进行缺血饥饿传代培养,诱使细胞处于“静止”状态,以便调整染色体结构,从而有助于核的重组与发育,他们使用这种方法建立了绵羊TNT4细胞系,该细胞形态类似于胚胎干细胞,但更扁平、上皮化。
1.2 体细胞

1.去膜:

1材料和方法

最早用青蛙肠粘膜上皮细胞获得了后代。Wilmut等用绵羊乳腺细胞获得Dolly羊。美国夏威夷大学Ryuzo
Yanagimachi教授领导的一个国际科研小组于1998年以小鼠卵丘细胞为核供体,采用吸移管注入,利用机械和化学激活方式进行细胞的融合,成功培育三代克隆小鼠。对小鼠、牛体细胞移植的相关研究中发现休眠的颗粒细胞核与去核MⅡ期卵母细胞构成的体细胞重构胚,其发育率及产生克隆后代的能力远高于其它类型的休眠体细胞,这可能缘于颗粒细胞上存在着与卵母细胞紧密联系的胞质微绒毛桥的缘故,它或许有助于供体核同受体核胞质因子的交换。

经人工催产使蛙卵成熟。挤出成熟的蛙卵,逐个去掉卵胶膜,接着把卵整齐地排列在高温灭菌过的培养皿内,使其粘于皿底。并使卵子动物极朝上,以便进行激动和挑核。然后加入适量的手术液,每次可在一个培养皿内排列卵25-40个。

1.1材料1.1.1实验动物健康、清洁级和远交系昆明小鼠,6~10周龄,体质量16~22g,雌性若干。健康、清洁级和近交系C57BL/6j小鼠,6~8周龄,体质量16~22g,雌性若干。购自南方医科大学实验动物中心。1.1.2主要试剂孕马血清促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素、透明质酸酶、细胞松弛素B、bisbenzi-mide、聚乙烯吡咯烷酮、PBS液、二氯化锶溶液和矿物油等。1.1.3细胞培养基有HEPES-CZB培养基[5]、CZB培养基[5]、无钙CZB培养基[5]和含5.55mmol/L葡萄糖的CZB培养基[6]等。所有培养基在使用时均以矿物油覆盖。1.1.4胚胎融合液[7]由300mmol/L甘露醇、0.1mmol/L硫酸镁、0.1mg/ml聚乙烯醇和3mg/ml牛血清白蛋白组成。1.1.5胚胎裂解液[8]由10mmol/LTris·HCl、50mmol/LKCl、2.5mmol/LMgCl2、0.1%明胶、0.45%NP-40和0.45%Tween20组成。使用前加入60μg/ml蛋白酶K。1.1.6主要仪器设备显微操纵仪、体视显微镜、拉针仪、微煅烧仪、磨针仪、毛细玻璃管、KefaCE-450型电脉冲细胞融合仪、CO2培养箱、电融合槽、PCR扩增仪、紫外凝胶摄像仪、恒温循环水浴锅、高速冷冻离心机和衡温水浴摇床等。1.2方法1.2.1MⅡ期卵母细胞的收集雌性KM小鼠,腹腔注射PMSG5IU,间隔48h后腹腔再注射HCG5IU,13~15h后颈椎脱臼法处死。从输卵管壶腹部获得卵母细胞-卵丘细胞复合体,置于含有0.1mg/ml透明质酸酶的HEPES-CZB培养基中,待卵母细胞周边的卵丘细胞全部分散为单个细胞时,停止消化。将卵母细胞转移到CZB培养基中,37.0℃、5%CO2培养箱培养到去核前。1.2.2供体卵丘细胞的准备雌性C57BL/6j小鼠,与获得MⅡ期卵母细胞的小鼠同法超排,分离卵母细胞-卵丘细胞复合体后,亦将其置于含有0.1mg/ml透明质酸酶的HEPES-CZB培养基中。待卵母细胞周边的卵丘细胞全部分散为单个细胞时,停止消化。将卵丘细胞转移到含有10%PVP的HEPES-CZB培养基中,37.0℃、含5%CO2培养箱培养1h。1.2.3核移植1.2.3.1MⅡ卵母细胞的去核选择细胞饱满、透明带界面清晰、无分裂碎片和第一极体明显可见的卵母细胞用于去核[9]。将待去核的卵母细胞,放入含5mg/ml细胞松弛素B的HEPES-CZB的操作液滴中,培养10~15min。用持卵针固定卵母细胞,将第一极体置于时钟3点的位置。在第一极体下方,用尖端封闭细长的去核针轻轻刺入透明带达卵周隙,经过第一极体基部,到达第一极体上方的透明带,将透明带切开一个大约25mm的小口。首先将第一极体挑出,然后使用去核针轻轻地挤压卵母细胞,并联合持卵针对卵母细胞行适当的负压吸引,去除极体下方包含有MⅡ期染色体-纺锤体复合体的最少量细胞质[10]。

『2 受体细胞的获得及其去核』

  1. 激动:

图片 1

作为细胞核移植的受体细胞主要有三类:去核的卵母细胞、受精卵和2-细胞胚胎,其中卵母细胞应用最为广泛。近来有人用两个去核卵母细胞融合后产生的胞质作为受体进行各代核移植,以增加核移植胚胎的细胞数和提高继代移植效率。研究证明,体外成熟培养的卵母细胞核移植成功率不如体内成熟的卵母细胞,其原因可能是卵母细胞在体外成熟过程中,需要合成一些蛋白质来完成第一次减数分裂,体外成熟的一些卵母细胞其活动有可能受到抑制。

蛙卵在未受精前仍处于第二次成熟分裂的中期。为了使卵子完成第二次成熟分裂,排出第二极体,在双目解剖镜下,用一枚消毒过的玻璃针在动物极靠近赤道的地区浅刺一下,目的是代替自然受精时精子入卵的过程。由于针刺动作比精子入卵的速度快得多,所以针刺手术要轻缓。激动后的卵子,10-15分钟后产生第二极体。在解剖镜下可见动物极附近有一折光的圆形小球,此即第二极体。

2.1 卵母细胞的去核方法 2.1.1 盲吸法
用微细玻璃管在第一极体下盲吸,吸除第一极体及处于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质,但该方法成功率低。为提高去核率,利用Hoechst33342染料对染色质的特异性染色作用,在荧光显微镜下去核后判断去核是否完成,去核准确率大为提高。Stice等用Hoechst33342染色,在紫外线下照射的时间控制在10s以内,未观察到对胚胎发育的负面影响。
2.1.2 半卵法
用微细玻管针在透明带上做一切口后,用微细玻管吸去一半染色质至另一半空透明带内,即将卵母细胞分为两半,然后用Hoechst33342染色,确定不含染色体的一半为细胞质受体。其操作方法如下,将卵母细胞移入35mm含有mPBSA的皮氏培养皿中进行显微操作,首先分两步进行分割透明带,即先在透明带上切一小口,然后用另一切割针扩大切口,从而分割透明带。透明带被切除后转移到含有mPBSA+5μg/ml细胞松弛素B的35mm的皮氏培养皿中作用3一5min,然后用固定针固定,分割针进入透明带的隙口中并将该针固定在靠着透明带的地方,缓慢吸取卵母细胞液,当分割针中吸取了一半卵母细胞液时,这时将该针从卵黄隙中移出,并靠着透明带切割边缘轻微地擦过以达到完全的分割,将其针中的卵母细胞液移入准备好了的空透明带中,并用Hoechst33342染色,荧光显微镜下观察不发荧光的作为受体卵母细胞。
2.1.3离心去核
Tatham等以150OOg、2min离心牛卵母细胞,用链霉蛋白酶去除卵母细胞透明带,经渗透压梯度离心,MⅡ期纺锤体可从大多数卵母细胞中分开,把无透明带的去核胞质作核移植的供质,同分裂球聚集经电融合成核移植胚,最后放入藻酸钠假透明带中,能在体外卵裂和发育,但其效果还有待于进一步研究。
2.1.4 末Ⅱ期去核法
Bordignon等提出把卵母细胞先激活使之处于末Ⅱ期,在排出第二极体时吸出第二极体及周围的少量细胞质,从而达到去核。这种方法避免使用DNA染料和经紫外线照射来定位染色体,并且去除的细胞质相对较少。该去核方法比MⅡ期去核的成功率有显著提高,但这种细胞质容易老化,是否能对基因组完全重排序,顺利完成后期发育,有待于研究。
2.2 去核时间与去核成功率
多数研究者在多数卵母细胞出现第一极体的成熟时期去核,去核时间,体内成熟在发情开始后48h,体外成熟22-24h。卵母细胞去核程序与重构胚中再程序化状况密切相关,去核率越高,其克隆胚最终发育成正常胚的可能性越大。去核率的高低与卵母细胞所处的成熟时期以及所采用的方法密切相关。以前的核移植研究均采用未激活的卵母细胞作为核受体,并认为激活后卵母细胞的重排能力会下降,影响核移植的效率。但Ushijima,等和Terlovw等;研究表明,激活后的卵母细胞作为核供体时,重构胚融合和发育能力均优于融合激活同时进行的效果。
2.3 胞质容士与重构胚的发育潜力

  1. 挑核:

有人对核反比例与重构胚发育的关系进行研究,结果表明,卵母细胞去除的胞质量与预期供核体积大小相当时,可以为细胞周期的相互作用创造最好的条件,而去除太少或太多并不理想。基于去除细胞质的量与去核率关系密切,因此,在保证有较高的去核情况下。去除的胞质应尽量少。

当第二极体出现时,用一枚消毒过的玻璃针在极体处斜插入卵子表层,然后迅速提起针尖,由于卵黄膜的破裂,极体下的卵核随着一小部分细胞质流出卵外,形成一个卵外球,一般极体排出15分钟以后会逐渐消失。这样挑核应在极体出先后10分钟内完成,否则核将沉入卵子中心,去核手术不易成功。

『3 核卵重组』

  1. 再去膜:

在显微操作仪操纵下,用一直径接近卵裂球大的移植针吸取一枚分离出的完整卵裂球,注入去核的受体卵母细胞的间隙中,根据移人的部位不同,可分为带下移植和细胞质内注射。那些卵裂球很难分离的胚胎可以在添有钙和镁-游离的磷酸缓冲盐溶液的mPBSA中孵育30-6Omin使细胞分裂停止。但孵育时间超过6Omin,细胞膜的完整性将遭到破坏,操作过程中细胞的溶化率将增加。在移植针移开后,对移植卵裂球上方的透明带施加压力使卵裂球与半卵母细胞接触。

挑核后经过10分钟左右,待伤口基本愈合时,用两把磨的很尖的钟表镊子,渐次剥去卵外胶膜,直至余下一层受精膜为止。操作步骤如下:在双目解剖镜下,先将一把尖头镊子的一边尖端从卵子附着皿底的胶膜处小心而快速地插入到最内层胶膜,然后夹紧胶膜,把卵固定住,再用另一把镊子从卵子另一侧夹紧胶膜,向上向后把胶膜掀去,若用两把镊子左右对拉,则易损伤卵子,且使卵质变位,影响胚胎发育。

『4 细胞融合/激活』

剥膜后的卵子移到盛有手术液的培养皿中置于玻璃板上,供注核用。

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